radioinmunoensayo - Wikilingue - Encydia
O Radioinmunoensayo (ou abreviado RIA do inglês Radioimmunoassay) é tipo de inmunoensayo ou método radioinmunométrico que se baseia na formação específica dos complexos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) o que lhe dota de uma grande especificidad unido à sensibilidade dos métodos radiológicos. A técnica tem sido praticamente substituída pelo método ELISA o qual mede a união Ag-Ac mediante colorimetrías em lugar de radiometrías . Quase todas as moléculas podem ser antigénicas e isto se usa para que os anticuerpos possam unir a essa molécula e a marcar radiactivamente. Uma boa maneira de provocar que uma molécula seja antigénica está baseada em que um hapteno combinado com um coadyugante dá resposta inmune. Um coadyugante muito usado é a Albúmina de suero bovino (BSA) pelo que ao conjugar um hapteno com BSA e introduzir em outra espécie aparecerão Anticuerpos contra o hapteno.
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Radioinmunoensayos
RIA Directo
O RIA baseia-se na concorrência existente entre o antígeno não marcado e uma quantidade conhecida do antígeno marcado para formar os complexos AgAc ou Ag*Ac. Com estes três componentes (Ag, Ag* e Ac) pode realizar-se o ensaio no que mantendo constante a quantidade de Ag* e Ac observar-se-á que a maior quantidade de Ag menos Ag* fica unido à quantidade fixa de Ac (e por tanto menos radiactividad), o que permitirá relacionar a radiactividad com a concentração de Ag.
- Obtêm-se anticuerpos específicos, para isso se injectam em um animal pequenas quantidades em várias doses do antígeno muito apurado. O animal gerará anticuerpos que poderão ser recolhidos do plasma sanguíneo.
- Marca-se o antígeno radiactivamente. O antígeno marcado deve seguir sendo reconocible pelo anticuerpo.
- Acrescentam-se Ac a uma placa de titulación e ficam unidos ao suporte sólido, depois do que se agrega o Ag* em quantidade conhecida e o Ag da mostra problema.
- Elimina-se o antígeno não unido por decantación e lavagem, e se determina a quantidade de marcação unido.
- Se interpola o valor obtido na recta de calibración que deve se ter realizado anteriormente.
| Antisuero | Ag* | Ag | Suero normal | |
|---|---|---|---|---|
| Cano 1 | 1ml | 1ml | 0ml | 1ml |
| Cano 2 | 1ml | 1ml | 0,1ml | 0,9ml |
| Cano 3 | 1ml | 1ml | 0,2ml | 0,8ml |
| Cano 4 | 1ml | 1ml | 0,3ml | 0,7ml |
| Cano 5 | 1ml | 1ml | 0,4ml | 0,6ml |
| Cano 6 | 1ml | 1ml | 0,5ml | 0,5ml |
| … | … | … | … | … |
Para a realização do calibrado dispõe-se de vários canos nos que se acrescentam uma quantidade fixa de Ac e de Ag* e uma quantidade variável de Ag à que se acrescenta suero normal para enrasar ao mesmo volume. Assim obteríamos uma tabela como a adjunta.
No cano 1 Ac não se une a Ag. No cano 2 a maioria une-se a Ag*, a concorrência vai-se deslocando pouco a pouco a Ag pelo que a radiactividad da mostra vai diminuindo (diminuem os complexos Ac-Ag*). Cria-se um recto R vs. [Ag].
RIA de Inhibición
Usado quando não se pode marcar o antígeno.
- Se inmoviliza uma quantidade constante de antígeno em um suporte sólido. Costuma-se saturar com BSA, leite em pó ou caseína para que não se uma nada mais ao suporte.
- Acrescenta-se uma quantidade constante de Anticuerpo marcado e o antígeno frio a medir (ou de calibrado). Neste passo estabelece-se uma concorrência na que o Ac se une ao Ag fixo ao suporte ou ao problema.
- Eliminam-se o anticuerpo não inmovilizado e o antígeno soluble e se determina a quantidade de anticuerpo marcado que se tem inmovilizado.
- Constrói-se uma curva de calibrado representando a quantidade de anticuerpo marcado inmovilizado em frente à concentração de antígeno soluble acrescentada ou bem se interpola a radiactividad medida nesta curva de calibrado.
RIA de Sandwich
- Se inmoviliza uma concentração fixa do Ac1 (não marcado) em um suporte sólido. Depois do que se satura o suporte.
- Acrescenta-se mostra-a problema (ou de calibrado) de Ag.
- Acrescenta-se Ac*2 (marcado) que se uma a outro epítopo do Ag.
- Eliminação do Ac*2 não unido.
- Determina-se a quantidade de anticuerpo marcado unido.
- A partir de um recta padrão se interpola o valor obtido para saber a concentração de Ag presente ou bem se realiza a recta de calibrado.
União não específica
Normalmente costumam-se obter valores de radiactividad acima do 0 quando [Ag]=0, isto se deve à união não específica (NSB). Costumam-se usar alguns pocillos para calcular o NSB que existe (fazendo um alvo de calibrado). Para isso se acrescenta a um pocillo 1ml de suero+1ml de Ag*+XML de Ag+(1-X)ml de suero e ao não acrescentar Ac se realiza o mesmo processo e ao lavar se mede a união não específica.
Referências
- García-Segura, J. M. e col. (2002). «1.17 Métodos Radioinmunométricos», Técnicas instrumentales de análise em Bioquímica, Madri: Síntese. 84-7738-429-0.
