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Rato de laboratório

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O rato de laboratório é um roedor, usualmente da espécie Mus musculus, que se utiliza para a investigação científica. Com frequência os ratos de laboratório são brancos, e alguns são albinos. Contém 40 cromosomas.

Ratos brancos.

Os ratos de laboratório devem pertencer a uma cepa pura ou endogámica. Os indivíduos de uma mesma cepa levam os mesmos genes, pelo qual se facilita a comparação dos efeitos dos diferentes tratamentos (fármacos, meio físico, etc.) sem que se produza confusão devido às diferenças genéticas. A cepa mais utilizada tem sido a C57, ainda que existem disponíveis muitas variedades, especialmente desde o desenvolvimento de técnicas de manipulação de genes que têm provisto uma grande quantidade de cepas com modificações genéticas particulares.[1]

Algumas investigações particulares podem requerer de uma espécie de rato diferente a Mus musculus. Por exemplo, em 2004 uns pesquisadores da Universidade de Emory utilizaram os ratos das praderas (Microtus ochrogaster) e os ratos dos pântanos (Microtus pennsylvanicus) para estudar um gene relacionado com o comportamento monógamo.

As características que têm feito do rato de laboratório o modelo biológico e biomédico mais utilizado nas investigações científicas são:

  1. Seu fácil manejo
  2. Seu tamanho apropriado para a criação e manipulação
  3. Não requerem demasiados cuidados.
  4. Têm um sistema inmune similar ao dos seres humanos.
  5. Têm um alto número de crianças.
  6. Possuem um breve período de gestación (19-21 dias), e seu destete é rápido.
  7. As fêmeas produzem um grande número de óvulos , os quais ao ser fecundados são muito resistentes.
  8. Ao ser mamíferos euterios, possuem um genoma muito similar ao dos seres humanos.

Na actualidade utilizam-se ratos que se manipularam geneticamente. Os modelos de rato transgénico e knock-out são particularmente úteis para estudar problemas biológicos complexos, já que pode-se analisar a acção de um gene ou uma proteína em particular.

Conteúdo

Cepa C57BL/6

A C57BLACK6, abreviada como C57BL/6 ou black 6, é a cepa endogámica de rato de laboratório mais amplamente usada para ser manipulada geneticamente no estudo das doenças humanas. Esta cepa foi a que se utilizou para o projecto genoma do rato que terminou em 2002.

Seu pelaje é café escuro, quase negro. Tem um temperamento facilmente irritable.

Contexto genético e evolutivo

Os seres humanos e os ratos de laboratório (ambos mamíferos euterios) compartilharam um último antepassado comum faz 60 milhões de anos aproximadamente. A evolução do genoma dos mamíferos é relativamente conservadora. Conquanto os humanos possuem antepassados comuns com todos os seres vivos, o facto que os humanos e os ratos sejam mamíferos euterios faz que tenham mais genes em comum que os que poder-se-iam encontrar entre os humanos e animais não euterios.

Os ratos têm um genoma agrupado em 25 pares de cromosomas , enquanto os seres humanos têm 23. Os genomas dos humanos e os ratos de laboratório são muito similares; o genoma dos humanos possui 2.900 milhões de pares de bases, enquanto o do rato contém ao redor de 2.600 milhões.

O mapeo genético tem posto em evidência que alguns genes que se encontram em um mesmo cromosoma humano estão localizados em diferentes cromosomas nos ratos. Por exemplo, no cromosoma 12 dos seres humanos encontram-se agrupados os genes GADP, TPI, LDHB, KRAS2, INT1, GL1 e LALB, enquanto no rato estes genes encontram-se repartidos nos cromosomas 6, 15, 10 e 4. Estes mesmos genes encontram-se em um mesmo cromosoma nos gatos (cromosoma B4) e nas vacas (cromosoma 5), o que indica que os antepassados dos ratos divergieron da linhagem que desembocaria no homem dantes que as linhagens dos artiodáctilos (grupo ao que pertence a vaca) e o dos carnívoros (grupo ao que pertence o gato). O cromosoma 7 humano possui homologías em sete cromosomas diferentes de Mus musculus. O cromosoma 11 do rato tem homologías em ao menos seis cromosomas humanos.[2]

O parecido genético entre as duas espécies permite comparar os genes quase directamente, e permite aos cientistas encontrar os mesmos genes em humanos para decodificar as rotas e mecanismos das doenças humanas, porque os ratos também podem as desenvolver. Por exemplo, a mutación murina relacionada com a obesidad (Magohany) é homóloga ao gene attractrin, o qual guarda informação para fazer uma glicoproteína e se relaciona com a obesidad nos seres humanos.

Também é possível induzir nos ratos um grande número de doenças humanas manipulando seus genes por médio de técnicas de engenharia genética. Só desta maneira se podem fazer investigações mais fiáveis, já que a investigação com humanos estaria por fora das normas bioéticas.

Rato transgénico

Passos para a criação de um rato transgénico.

Um rato transgénico é um rato que porta um fragmento de DNA alheio a seu genoma. Para obtê-los, é necessário construir um plásmido de DNA (um plásmido é um elemento genético extracromosomal cuja corrente de DNA é circular) e introduzir logo o novo gene na célula branco para que se insira a esmo no genoma celular com técnicas de DNA recombinante e de micromanipulación ou transfección. O gene acrescentado recebe o nome de transgen , e o animal que o porta, o de animal transgénico. Os ratos transgénicos utilizam-se para conhecer os mecanismos da expressão genética de um gene ou de um fragmento deste.

A obtenção de um rato transgénico leva-se a cabo da seguinte maneira:

  1. Obtêm-se óvulos fecundados, nos que ainda não se fundiram os pronúcleos masculino e feminino, de um rato fêmea ao que previamente se lhe aplicou uma inyección de estro e depois foi juntado.
  2. Os óvulos fertilizados removem-se do oviducto utilizando uma solução salina.
  3. Por médio de uma pipeta de vidro ultrafina injecta-se ao pronúcleo masculino cerca de 2 a 5 picolitros de DNA, no que há centos de cópias do transgen.
  4. O passo anterior realiza-se em cerca de 10 a 20 ovos.
  5. Os ovos microinyectados implantam-se em uma mãe adoptiva (denominada pseudopreñada, pois foi juntada previamente com um macho estéril).
  6. 19 – 21 dias depois nascem as crianças, das quais aproximadamente entre o 10 e o 40 por cento terão o transgen integrado em seu genoma.
  7. Toma-se uma mostra de tecido de sua bicha para averiguar que indivíduos portam o transgen.
  8. Isolam-se os ratos transgénicos obtidos de um ovo microinyectado, denominados transgénicos fundadores.
  9. Cruzam-se ratos transgénicos fundadores para obter uma linha de ratos transgénicos.

O número de cópias do transgen pode variar entre diferentes ratos transgénicos fundadores; do mesmo modo, o transgen pode integrar-se em diferentes partes dentro do genoma murino. Alguns ratos transgénicos podem expressar um novo fenotipo devido à inactivación de outro gene devido ao lugar de inserção do transgen, o qual é uma desventaja da técnica. Em general, os modelos gerados permitem estudar o ganho de uma função.

Um gene tem duas regiões principais: a região reguladora (promotor) e a região codificadora da proteína. Na construção de ratos transgénicos, podem-se usar promotores gerais que permitem uma expressão contínua e generalizada do transgen, ou bem um promotor tecido-específico que produzirá um padrão de expressão mais restringido.

Rato knock-out

Um rato knock-out (KO) é um organismo geneticamente modificado (OGM) que carece da expressão de um gene em particular. Os ratos KO são um modelo para estudar a acção de um gene particular na bioquímica e fisiología de um organismo. Os ratos knock-out são muito úteis no estudo do cancro e de outras doenças complexas.

Rato KO.

A obtenção de um rato KO leva-se a cabo da seguinte maneira:

  1. Extrai-se o gene de interesse.
  2. Propaga-se o gene em uma bactéria.
  3. Desenham-se modificações genéticas para inactivar a função normal do gene.
  4. Durante a activação acrescenta-se um gene que gera resistência a um antibiótico. Com frequência utiliza-se o gene Neo, o qual dá resistência à neomicina. Este gene marcador gerará uma “selecção positiva” (só as células que o portem sobreviverão).
  5. Acrescenta-se também outro gene de selecção negativa (as células que o portem morrerão) aos extremos do gene que se pretende modificar. Usualmente o gene de selecção negativa é o gene timidina quinasa do herpes vírus (tk). Este gene deve ser eliminado pela maquinaria celular durante o processo de recombinación homóloga.
  6. Prepara-se in vitro um vetor de DNA. Usualmente o vetor é um retrovirus.
  7. Põe-se o vetor em contacto com células É em suspensão. As células É provem de ratonas grávidas às que se lhes extraíram os embriões no estado de blastocisto , no terceiro dia de de desenvolvimento.
  8. Aplica-se um choque eléctrico (electroporación) que cria um poro na membrana das células É, com o que se facilita a entrada do vetor.
  9. O gene normal é substituído com o gene modificado, através de um processo chamado recombinación homóloga.
  10. Aplica-se o antibiótico de selecção (geralmente neomicina) ao cultivo de células embrionarias.
  11. Morrem aquelas células que por casualidade tenham incluído o gene de selecção negativa (usualmente o tk) nos extremos do gene. As células que ficam no cultivo se denominam recombinantes.
  12. Se microinyectan entre 10 e 12 células principais embrionarias (É por suas siglas em inglês) recombinantes em embriões de rato.
  13. Implantam-se os embriões em uma ratona pseudopreñada.
  14. Nascem os ratos provenientes destes embriões. Como os embriões modificados estavam formados por dois tipos de células, se diz que estes organismos são quimeras.
  15. Realizam-se cruzes para gerar uma cepa de rato com um determinado gene modificado. Tem-se em conta que só um 50 por cento das crianças das quimeras serão recombinantes.

Entre as desventajas que tem a investigação com ratos noqueados se podem mencionar as seguintes: a possível mortalidade dos embriões ou dos recém nascidos, em alguns casos, o que impede o estudo da função desse gene particular nos animais adultos; a modificação está presente a todas as células, o qual não se dá no desenvolvimento de alguns tipos de cancro; a modificação está presente desde a fecundación, de forma tal que em alguns casos a plasticidade durante o desenvolvimento embrionario pode conduzir a uma interpretação confusa dos resultados por fenómenos de compensação.

Apesar das anteriores limitações, o conhecimento da genética médica tem crescido enormemente graças aos ratos KO.[3]

Cepas de ratos knock-out

No 2001 tinham-se não menos de 286 cepas de ratos knock-out disponíveis. A cada mês acrescentam-se nove cepas novas à lista. O Jackson Laboratory Induced Mutant Resource (IMR) é a instituição que leva a cabo a importação, criopreservación de embriões e desenvolvimento genético (colocando a mutación em uma cepa consanguínea) das cepas aceitadas, para proveer à comunidade científica de ratos knock-outs e transgénicos para as diferentes áreas de investigação.

O nome da cepa dá-se segundo o gene envolvido na mutación. Por exemplo, a cepa BDNF recebe seu nome das siglas em inglês de brain-derived neurotrophic factor (isto é, o factor neurotrófico derivado do cérebro). O fenotipo da cepa com esta mutación caracteriza-se por severas deficiências em coordenação e balanço e uma excessiva degeneração em alguns ganglios sensoriales. O ganglio simpático, o cérebro médio dopaminérgico e os neurónios motores não se encontram afectados.

Rato knock-in

Um rato knock-in é um organismo geneticamente modificado (OGM) ao qual se lhe tem substituído um gene normal por um alterado com uma mutación específica. Sua elaboração é muito similar à de um rato knock-out; no entanto, em lugar de inhabilitar o gene, este se substitui por outro. Em alguns casos os que se faz é acrescentar a secção promotora para fazer que o gene modificado se expresse continuamente.

Desenvolvimento evolutivo e história de seu uso

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Durante o século XX documentaram-se as mutaciones espontáneas que permitiram identificar os genes responsáveis da obesidad, o cancro e a aterosclerosis.


A história subsiguiente inclui a criação de uma grande quantidade de variedades de ratos noqueados para ajudar a entender o papel que desempenha a cada um dos genes no organismo e a forma como se relaciona com outros genes.

Referências

  1. Meraz Rios Marco Antonio e Sánchez Torres Carmen, Animais modificados geneticamente: A ferramenta do futuro.
  2. Ruiz García, Manuel; Álvarez, Diana (2002). Evolução comparada de genomas animais e sua relação com o genoma humano (cap. 6). No genoma humano. Editorial Panamericana. Bogotá, Colômbia.
  3. Jiménez Schuhmacher, Alberto. O rato como modelo animal em oncología: Passado, presente e futuro. Em Boletim Oncológico da área sanitária de Teruel. Março 2007.
  4. Roedores. Em Pequenos herbívoros. Edições Folio. Estella. 1991. | Dubock, Adrian C.
  5. Da magia primitiva à medicina moderna. Fundo de Cultura Económica. | Pérez Tamayo, Ruy
  6. Breve história da química. Educational Services Incorporated. 1975. | Asimov, Isaac.
  7. A relação do homem com o rato caseiro. Em Pequenos herbívoros. Edições Folio. Estella. 1991. | Berry, R. J.
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