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SDS-PAGE

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Imagem de SDS-PAGE. O marcador molecular corre na rua da esquerda.

SDS-PAGE é o acrónimo em inglês de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato sódico). É uma técnica amplamente utilizada em bioquímica, genética, biologia molecular e ciência forense para separar as proteínas de acordo a sua mobilidade electroforética (em função da longitude da corrente polipeptídica, massa molecular, modificações postraduccionales e outros factores). Graças ao SDS a maioria de proteínas adquirem uma relação carrega massa idêntica, pelo que se obtém um fraccionamiento que obedece unicamente à longitude da corrente. É o método de electroforesis empregado com maior profusión para analisar proteínas.

Conteúdo

Procedimento

A dissolução de proteínas que se vão analisar se mistura em primeiro lugar com SDS, um detergente aniónico que desnaturaliza as proteínas, eliminando suas estruturas secundária e terciária (mas sem alterar os enlaces disulfuro e ademais confere um ónus negativo à cada proteína em proporção a sua massa.[1] [2] [3] Sem SDS, as diferentes proteínas que têm massas moleculares similares migram de forma diferente devido a diferenças na proporção carrega massa, já que a cada proteína tem um ponto isoeléctrico diferente. Se a electroforesis realiza-se assim, sem acrescentar SDS, se fala de PAGE nativa. O problema resolve-se acrescentando SDS, já que ao unir-se e despregar a proteína, proporciona-lhe um ónus negativo quase uniforme ao longo da longitude da corrente polipéptidica.

O SDS une-se em uma proporção de aproximadamente 1,4 g SDS por 1,0 g de proteína (ainda que as proporções de união podem variar entre 1,1 e 2,2), proporcionando uma relação carrega massa aproximadamente uniforme para a maior parte das proteínas, de maneira que pode-se assumir que a distância de migração no gel está directamente vinculada só ao tamanho da proteína despregada (longitude de sua corrente, número de aminoácidos ou massa molecular). Pode-se acrescentar um colorante plotadora à dissolução de proteínas para permitir ao experimentador seguir o curso da electroforesis.

Ingredientes químicos e seus papéis

O gel de poliacrilamida era já conhecido como um médio potencial para a inclusão de tecidos seccionados em 1959 .[4] [5] Trata-se de um gel sintético, termoestable, transparente, resistente, relativamente inerte, quimicamente falando, que pode se preparar com um amplo intervalo de tamanhos médios de poro.[6] O tamanho de poro de um gel está determinado por dois factores: a concentração total de acrilamida presente (%T) (T = concentração total de monómeros de acrilamida e bisacrilamida) e a quantidade do reticulador (%C) (C = concentração do reticulador). Os tamanhos de poro diminuem quando aumenta T, e com reticulación o 5%C produz o menor tamanho de poro. Qualquer incremento ou diminuição em C aumenta o tamanho de poro (função parabólica). Isto parece dever à estrutura não homogénea dos filamentos do gel.

O gel formado a partir deste material também pode resistir gradientes de alto voltaje, ser viável para vários procedimentos de tinción e destinción e pode ser digerido para extrair fracções separadas ou desecado para seu autorradiografía e registo permanente. A electroforesis em disco utiliza geles de diferentes tamanhos de poro.[7] [8] O nome de electroforesis em disco deriva do acrónimo inglês DISC, que faz referência às descontinuidades na matriz electroforética e por coincidência à forma discoidal das zonas separadas de iones. Há duas capas de gel, o gel de empilhamento ou espaçador e o gel de resolução ou separador.

Imagem de Microscopía electrónica de transmissão de um gel de poliacrilamida. O tamanho de poro de um gel este determinado pela quantidade total de monómero presente (%T) e a quantidade de reticulador (%C).

Gel de empilhamento

O gel de empilhamento é um gel de poliacrilamida com tamanho de poro grande (4%T). Este gel está preparado com um tampón de Tris /HCl com um pH de 6,8, duas unidades de pH menor que o tampón de electroforesis (Tris/glicina). Estas condições proporcionam um ambiente para as reacções de Kohlrausch que determinam a conductividad molar, e como resultado, as proteínas recobertas com SDS se concentram várias vezes, resultando assim em poucos minutos uma zona de início da ordem de 19 μm. Este gel coloca-se sobre o gel de resolução. A altura da zona correspondente ao gel de empilhamento deve ser superior ao duplo da altura e o volume da mostra que vai ser aplicada.

Gel de resolução

O gel de resolução é um gel de poliacrilamida de poro pequeno (3 - 30% de monómero de acrilamida) que tipicamente se confecciona utilizando um tampón Tris/HCl com um pH de 8,8. No gel de resolução é onde as macromoléculas se separam de acordo a seu tamanho. Os geles de resolução têm um intervalo óptimo de separação dependente da percentagem de monómero utilizado para sua preparação. Por exemplo, podem-se utilizar eficazmente geles com conteúdos de 8%, 10% e 12% para separar proteínas de 24 a 205 kDa, 14 a 205 kDa, e 14 a 66 kDa, respectivamente.

Ingredientes químicos

Reactivos para o processamento e a visualização

Utilizam-se os seguintes reactivos para o processamento do gel e as mostras de proteínas que se visualizam em o:

SDS-PAGE redutora

Além da adição de SDS, pode-se aquecer opcionalmente as proteínas durante um breve tempo a uma temperatura próxima à de ebullición em presença de um agente redutor, como o ditiotreitol (DTT) ou o 2-mercaptoetanol (ou beta-mercaptoetanol), que contribuirá a desnaturalizar as proteínas reduzindo os enlaces disulfuro, despregando assim algumas formas de plegamiento terciário e rompendo a estrutura cuaternaria (subunidades oligoméricas). Isto é o que se conhece como SDS-PAGE redutora, e se utiliza de maneira habitual. Este procedimento não se usa quando a estrutura nativa é importante para análise posteriores (p.ex. actividade enzimática, que se mostra mediante o uso de zimogramas). Um exemplo seria o QPNC-PAGE, (de Quantitative Preparative Native Continuous PAGE, em inglês: PAGE de preparação, cuantitativa, nativa e contínua). É um novo método para a separação de metaloproteínas nativas em matrizes biológicas.

Electroforesis e tinción

Dois geles SDS-PAGE depois de completar a electroforesis.

As proteínas desnaturalizadas são posteriormente aplicadas em um extremo de uma capa do gel de poliacrilamida em um tampón químico adequado. Aplica-se uma corrente eléctrica que percorre o gel, provocando que as proteínas com ónus negativo migrem através dele em direcção ao ánodo. Dependendo de seu tamanho, a cada proteína mover-se-á de modo diferente através da matriz do gel: as proteínas de tamanho curto encaixarão mais facilmente através dos poros do gel, enquanto as de tamanho maior terão maior dificuldade para fazê-lo (encontrarão maior resistência). Depois de um verdadeiro tempo (habitualmente umas horas, ainda que isto depende do voltaje aplicado ao gel: deve-se ter que voltajes maiores produzem uma migração mais rápida, mas tendem a produzir uma resolução algo mais deficiente), as proteínas terão migrado de forma diferencial em base a seu tamanho. As menores deslocar-se-ão mais rápido, enquanto as maiores permanecerão mais cerca do ponto de origem. Por tanto, as proteínas separar-se-ão aproximadamente de acordo a seu tamanho (e por tanto, seu peso moleculasr). Depois da electroforesis, o gel deve ser teñido (o mais habitual com Coomassie blue ou tinción argéntea, permitindo a visualização das proteínas separadas ou seu processamento posterior (ej.: Western blot). Depois da tinción, as diferentes proteínas apareceran como bandas diferentes no gel. É comum correr marcadores moleculares de tamanho molecular conhecido em uma rua a parte do gel para calibrarlo e determinar o peso de proteínas desconhecidas comparando a distância percorrida com a do marcador. O gel forma-se em realidade porque a solução contém uma pequena quantidade, normalmente 1 parte em 35 de bisacrilamida, que pode formar enlaces cruzados entre duas moléculas de poliacrilamida. A proporção entre ambas substâncias pode variar de acordo ao propósito para o que se desenha.

A electroforesis em gel é normalmente a primeira opção em um ensaio de pureza de proteínas devido a sua confiabilidade e a sua singeleza. Mesmo assim podem-se dar falsos positivos e negativos. Um contaminante que migre conjuntamente pode aparecer na mesma banda que a proteína desejada. Esta comigración também pode fazer que a proteína migre em uma posição diferente ou não seja capaz de penetrar no gel. Isto é pelo que é importante teñir o gel completo, incluída a secção de empilhamento (ou ónus). O colorante Coomassie Blue também pode se unir com menor afinidad às glicoproteínas e proteínas fibrosas, o que interfere com a cuantificación.

Tinción com prata

SDS- PAGE com tinción com prata.


No século XIV a técnica da tinción com prata desenvolveu-se para colorir superfícies de cristal. Foi amplamente utilizada para este propósito até o século XVI. A cor produzida pelas primeiras tinciones variava entre um amarelo claro e uma laranja rojizo. Camillo Golgi perfeccionó a tinción com prata para o estudo do sistema nervoso. O método de Golgi tiñe por completo um número limitado de células a esmo. O mecanismo químico exacto pelo que isto sucede ainda é amplamente desconhecido.[9] Kerenyi e Gallyas introduziram esta tinción como um procedimento sensível para detectar quantidades traça de proteínas em geles .[10] A técnica estendeu-se ao estudo de outras macromoléculas biológicas depois de sua separação por vários suportes.[11] A tinción de Coomassie Blue clássica pode detectar normalmente bandas de proteína de 50 ng, enquanto a tinción com prata incrementa este limite de sensibilidade em umas 50 vezes. Muitas variáveis podem influir na intensidade da cor e todas as proteínas têm características diferentes de tinción. Para uma boa tinción deve-se prestar atenção à limpeza do material de vidro, a pureza da água e dos reactivos.[12]

Sistemas de tamponamiento químico

Migração de proteínas postulada no sistema de gel Laemmli. A: Gel de ónus, B: Gel de resolução ou: aplicação de mostra-a c: descontinuidades na matriz electroforética e do tampón químico.

A maioria das separações de proteínas levam-se a cabo utilizando um sistema de tampón "discontinuo" em dissolução que incrementa significativamente a delgadez das bandas no gel. Durante a electroforesis em um sistema de gel discontinuo, forma-se um gradiente iónico nos estádios temporões da electroforesis que fazem que todas as proteínas se enfoquen em uma sozinha banda estreita. Isto sucede em uma região do gel que tem poros maiores de modo que a matriz do gel não retarda a migração no momento do enfocado ou "empilhamento". Os iones negativos do tampón contido no tanque "ultrapassa" o "pacote" de proteínas recobertas com SDS e eliminam o gradiente iónico de maneira que posteriormente as proteínas separam-se pela acção de tamiz na região do gel que está mais abaixo, a de resolução".

Muitas pessoas continuam utilizando o sistema de tamponamiento de tris-glicina, também chamado de "Laemmli" que empilha em um pH de 6,8 e resolve a Many people continue to use a tris-glycine or "Laemmli" buffering system that stacks at a 8.3-9.0. Estes níveis de pH favorecem a formação de enlaces disulfuro entre os residuos de cisteína nas proteínas, especialmente quando se encontram presentes a elevadas concentrações, como as faixas de pKa de cisteína variam entre 8-9 e também como o agente redutor presente ao buffer de ónus não migra conjuntamente com as proteínas. Os avanços recentes na tecnologia de tamponamiento minorizan este problema resolvendo as proteínas a um pH muito por embaixo do pKa de cisteína (p.ex., bis-tris, pH 6.5) e contêm também agentes redutores (p.ex. bisulfito de sodio) que se movem no gel por adiante das proteínas para manter um ambiente redutor. Um benefício adicional de utilizar tampones com pH mais baixo é a maior estabilidade do gel de acrilamida, de modo que os geles podem-se almacener durante períodos de tempo maiores dantes de seu uso.[13] [14]

Electroforesis de proteínas em gradiente por SDS

Migração de proteínas em geles de SDS a diferentes concentrações de acrilamida (%T). Mostra-se a migração de nove proteínas que vão desde 94 kDa a 14.4 kDa. O empilhamento e descompactación sucedem-se de modo contínuo no gel, na cada proteína com diferente concentração do gel. A linha de pontos indica a descontinuidade na interfase móvel Gly¯/Cl¯. As Proteínas entre o electrolito director rápido e o electrolito lento de arraste não se diluyen por difusão.

À medida que aplica-se um voltaje, os aniones (e as mostras de moléculas carregadas negativamente) migram para o eléctrodo positivo na câmara inferior, e o ión condutor é o Cl¯ (alta mobilidade e elevada concentração); o glicinato é o ión de arraste (baixa mobilidade e elevada concentração). As partículas de SDS-proteína não migram livremente entre a borda de Cl¯ odel tampón do gel e as de Gly ¯ do tampón do cátodo. Friedrich Kohlrausch encontrou que a lei de Ohm também se aplica aos electrolitos em dissolução. Já que o voltaje cai entre os buffers de cloro e glicina, as proteínas comprimem-se (empilham) em finas capas de micrômetros.[15] O frente move-se através de um gradiente de poro e o pacote de proteínas dispersa-se gradualmente devido a uma resistência por atrito a cada vez maior na matriz do gel. Dá-se contínuamente uma compressão e descompresión no gradiente do gel em diferente posição para a cada proteína. Para que se produza um desempaquetamiento completo a concentração de poliacrilamida deve superar o 16% T. O sistema de dois geles de "Laemmli" é simplesmente um gel em gradiente de poro. A descontinuidade de pH dos tampones não tem importância para a qualidade da separação, e não se precisa um gel de empilhamento com diferente pH.

Veja-se também

Referências

  1. Shapiro A O, Viñuela E, Maizel JV Jr. (September 1967). «[Expressão errónea: operador < inesperado Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.]». Biochem Biophys Rês Commun. 28 (5):  pp. 815-820. PMID 4861258. 
  2. Weber K, Osborn M (August 1969). «[Expressão errónea: operador < inesperado The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.]». J Biol Chem. 244 (16):  pp. 4406-4412. PMID 5806584. 
  3. Laemmli UK (August 1970). «[Expressão errónea: operador < inesperado Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4]». Nature 227 (5259):  pp. 680–685. PMID 5432063. 
  4. Davis BJ, Ornstein L (1959). «[Expressão errónea: operador < inesperado A new high resolution electrophoresis method.]». Delivered at the Society for the Study of Blood at the New York Academy of Medicine. 
  5. Raymond S, Weintraub L. (1959). «[Expressão errónea: operador < inesperado Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.]». Science 130:  pp. 711. PMID 14436634. 
  6. Rüchel R, Steere RL, Erbe EF (1978). «[Expressão errónea: operador < inesperado Transmission-electron microscopic observations of freeze-etched polyacrylamide gels.]». J Chromatogr. 166:  pp. 563-575. 
  7. Ornstein L (December 1964). «[Expressão errónea: operador < inesperado DISC ELECTROPHORESIS. I. BACKGROUND AND THEORY.]». Ann N E Acad Sci. 121:  pp. 321-349. PMID 14240533. 
  8. Davis BJ (December 1964). «[Expressão errónea: operador < inesperado Disc Electrophoresis. 2, Method and application to human serum proteins]». Ann. New York Acad. Sci 121:  pp. 404-427. PMID 14240539. 
  9. Golgi C (1873). «[Expressão errónea: operador < inesperado Sulla struttura della sostanza grigia do cervello.]». Gazzetta Medica Italiana (Lombardia) 33:  pp. 244–246. 
  10. Kerenyi L, Gallyas F (1973). «[Expressão errónea: operador < inesperado Über Probleme der quantitiven Auswertung der mit physikalischer Entwicklung versilberten Agarelektrophoretogramme]». Clin. Chim. Acta 47:  pp. 425-436. 
  11. Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (Sep 1979). «[Expressão errónea: operador < inesperado A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.]». Anal Biochem. 98 (1):  pp. 231-237. PMID 94518. 
  12. Hempelmann E, Schulze M, Götze Ou (1984). «[Expressão errónea: operador < inesperado Free SH-groups are important for the polychromatic staining of proteins with silver nitrat]». Neuhof V (ed)Electrophoresis '84 , Verlag Chemie Weinheim 1984:  pp. 328-330. 
  13. Schägger H, von Jagow G (1987). «[Expressão errónea: operador < inesperado Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.]». Anal Biochem. 166 (2):  pp. 368-379. PMID 2449095. 
  14. Wiltfang J, Arold N, Neuhoff V (1991). «[Expressão errónea: operador < inesperado A new multiphasic buffer system for sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of proteins and peptides with molecular masses 100,000-1000, and their detection with picomolar sensitivity.]». Electrophoresis 12 (5):  pp. 352-366. PMID 1718736. 
  15. Kohlrausch F (1897). «[Expressão errónea: operador < inesperado Ueber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen.]». Ann.J.Phys.ou.Chem. 62:  pp. 209-239. 

Enlaces externos

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